МНОГО РАСТИТЬ ЛЕГКО
Тел.:
+7 (843) 278–31–82
Skype:

TOPGROW

Стерильная технология и работа с агаром

Стерильная технология и работа с агаром

(Перевод CHAPTER II STERILE TECHNIQUE AND AGAR CULTURE из книги Пола Стаметса «The Mushroom Cultivator»)

Воздух которым мы дышим подобен живому океану кишащему микроскопическими организмами, он колышется приливами и отливами от малейшего дуновения ветерка. Плесени, бактерии, вирусы и растения используют атмосферу для распространения своего потомства в новые ареалы обитания. И если не предпринять определённые меры предосторожности, то эти микрочастицы могут сделать поддержание стерильности технологии затруднительным, однако если вам удастся пресечь или сильно сократить движение этих организмов в воздухе, то в успехе стерильной технологии можно быть практически уверенным.

Существует пять основных источников заражения при работе с грибной культурой:

1. Непосредственно окружающая среда (воздух);
2. Субстрат (носитель культуры);
3. Инвентарь для культивации;
4. Сам культиватор (грибовод) и его или её одежда;
5. Споры грибов или мицелий.

Грибы, как и вообще все живые организмы, постоянно конкурируют друг с другом за доступные питательные вещества. Создавая стерильные условия, вы просто даёте грибной культуре значительные преимущества перед несметным множеством других конкурентов. Пред тем как начать работу непосредственно с культурой, первым шагом будет изготовление камеры для инокуляции (Glowe-Box) или оборудование стерильной лаборатории.

Проектирование и обустройство стерильной лаборатории

Большинство грибоводов терпят неудачу в своих начинаниях только из-за того, что не удосуживаются оборудовать место для стерильной работы. Хотя всё что может для этого потребоваться это полдня работы по переоборудованию стенного шкафа или кладовки в приемлемую лабораторию для инокуляций.

Начните с того что уберите все коврики, шторки и прочие ткано-вязаные изделия в которых скрывается большое количество пыли и спор. Тщательно вымойте полы, стены и потолки с мягким дезинфектантом. Если вы покрасите помещение глянцевой белой эмалью, это упростит уборку в будущем. Закройте все окна и другие источники потенциальных сквозняков листовым пластиком. Либо с внешней, либо с внутренней стороны сконструируйте тамбур, который будет служить защитным шлюзом. Такая система будет выполнять роль защитного буфера между внешней средой и лабораторией. Тамбур следует организовать таким образом чтобы одна дверь могла бы оставаться закрытой, когда открывается другая дверь. Укомплектуйте лабораторию следующими предметами:

1. стул и устойчивый стол с гладкой поверхностью;
2. пропановая горелка, спиртовка или бутановая зажигалка;
3. чётко помеченный пульверизатор с 10% раствором гидрохлорида натрия (белизны);
4. стерильные чашки Петри и пробирки;
5. самоклеющиеся листочки (или лейкопластырь), блокнот, ручка и нестирающийся маркер;
6. нож для агара (скальпель) и инокуляционная петля.

Все эти предметы должны всегда оставаться в лаборатории. Если что-то  из этого было вынесено, перед возвращением убедитесь в абсолютной чистоте предмета.

Поддерживать в лаборатории условия близкие к стерильным можно простой тщательной уборкой с частотой зависящей от частоты использования помещения. Степень тщательности будет зависеть от насыщенности воздуха спорами в вашем конкретном случае. В зимний период объём свободно перемещающихся спор радикально снижается, тогда как весной и летом можно заметить очевидный рост этого объёма. Следовательно в эти периоды пикового роста количества контаминантов потребуется большая тщательность в уборке. Ещё более важно выносить из лаборатории все заражённые банки и чашки Петри способом не представляющим угрозы для стерильности лаборатории.

Завершив обустройство лаборатории необходимо строго и неколебимо блюсти в ней жёсткую гигиену. Помещение следует мыть с дезинфектантом, полы с шваброй и напоследок распылять 10% раствор белизны из пульверизатора. После распыления в лабораторию нельзя входить в течении 15 минут, пока не осядут все взвешенные в воздухе частицы. Вы ДОЛЖНЫ проводить весь комплекс гигиенических процедур перед каждой инокуляцией. Запомните как правило: заражение проще предупредить, чем уничтожить после появления.

Прежде чем продолжать, необходимо напомнить об осторожности. Стерильная работа требует концентрации, внимания к деталям и твёрдости руки. Работайте в пределах разумных промежутков времени, а не до полного изнеможения. Никогда не оставляйте без присмотра спиртовку или бутановую горелку и всегда помните о том что в замкнутом пространстве очень быстро заканчивается запас кислорода.

Некоторые грибоводы выводят войну с контаминантами за пределы разумного и иногда даже во вред собственному здоровью. Начинают «бойню» в лаборатории, накачивая её токсичными фунгицидами и бактерицидами, подвергая себя воздействию чрезвычайно опасных химических веществ. Вот был случай, когда лаборант вошёл в помещение основательно накачав его гермицидом на основе фенола (карболовой кислоты). Из-за высокой концентрации яда он потерял чувство опасности и через несколько минут испытал сильное затруднение дыхания, онемение конечностей и конвульсии. Эти симптомы продержались несколько часов и он полностью не восстановился даже через несколько дней. А вот ещё был случай, один человек установил в главбоксе коротковолновую ультрафиолетовую (кварцевую) лампу и проводил инокуляции голыми руками в течении месяца даже не подозревая об опасности. Источник света такого типа может вызвать рак кожи после продолжительного воздействия. Существуют альтернативные способы и средства не причиняющие или причиняющие незначительный вред здоровью и позволяющие бороться с контаминантами также, а иногда и более эффективно.

Если не смотря на все ваши сверх-усилия сохраняется высокий уровень контаминации, есть несколько дополнительных способов повышения стерильности. Первый, самый простой и недорогой, использует коллоидный раствор лёгкого масла распыляемый в воздухе лаборатории; второй включает в себя изготовление камеры с неподвижным воздухом, т.н. главбокс (glovebox – ящик с перчатками); а третий относительно дорог, т.к. требует использования высокоэффективных микронных фильтров.

1 – При распылении стерильного масла создаётся облако крайне вязких, маленьких капель. По мере оседания оно связывает все находящиеся в воздухе частицы. В этом способе используется триэтиленгликоль испаряемый с поверхности подогреваемого тампона. Мелкодисперсный и более летучий чем минеральное масло, триэтиленгликоль не оставляет сколько-нибудь заметной масляной плёнки. Использование триэтиленгликоля не отменяет стандартные меры по поддержанию гигиены.

2 – Главбокс – это воздухонепроницаемая камера, которая предоставляет условия для создания стерильной среды в которой и проводится работа с культурами. Простейшая конструкция представляет собой ящик из фанеры, со смотровым окошком. В отверстиях для рук закрепляются перчатки, в которые вставляются руки. Иногда вместо перчаток передняя часть ящика прикрываются сменной хлопковой тканью, которую следует периодически стерилизовать. Главное преимущество главбокса заключается в том что он, являясь уменьшенным в масштабе и недорогим подобием лабораторной комнаты, предоставляет удобный для чистки объём, в котором нет или почти нет движения воздуха и можно спокойно работать со стерильными культурами.

3 – Современные лаборатории решают проблему инфекции переносимой по воздуху установкой высокоэффективных воздушных фильтров частиц (high efficiency particulate air (HEPA) filter). Эти фильтры задерживают все частицы диаметр которых превышает 0,1–0,3 микрона, т.е. меньше любых спор грибов и практически всех бактерий. HEPA-фильтры встраиваются в т.н. ламинарные шкафы. В некоторых стерильных лабораториях из HEPA-фильтров набирается целиком герметичная стена или потолок и через них подаётся внешний воздух. В результате внутри лаборатории создаётся позитивное давление, которое не даёт проникнуть нестерильному воздуху. Устройство и типы ламинарных шкафов подробно обсуждаются в приложении IV.

У некоторых культиваторов практически не возникает проблем, при том что они работают в казалось бы совсем примитивных условиях. Другие испытывают явные проблемы с постоянными заражениями и им приходится вкладываться в высокотехнологичные устройства контроля окружающей среды. Каждые конкретные условия вынуждают принимать определённые контрмеры. И независимо от того выращиваете ли вы грибы дома или организовываете работу лаборатории, вы испытаете одинаковые трудности отличающиеся лишь в масштабах.

Приготовление агара

Завершив обустройство стерильной лаборатории следующим шагом можно приступать к приготовлению питательного носителя на основе агара. Агар – это вырабатываемое из морских водорослей студнеобразующее вещество наподобие, но несколько более эффективное чем желатин. Существует много рецептов приготовления обогащённых агаровых носителей пригодных для разведения грибной культуры. Стандартными можно считать картофельный (Potato Dextrose Agar (PDA)) и солодовый (Malt Extract Agar (MEA)) агары, которые нередко дополняют дрожжами в качестве питательной добавки. В микологических журналах часто упоминаются агары на пептоне и неопептоне – два самых доступных источника протеина для грибного мицелия. Есть ещё один тип агара, который авторы рекомендуют, на бульоне от варки ржи или пшеницы с добавлением солодового сахара (или мальтоза – дисахарид, образованный двумя остатками глюкозы).

Если вы испытываете трудности связанные с инфицированием бактериями, то добавление антибиотиков в питательный носитель предотвратит их размножение. Большинство антибиотиков, таких как стрептомицин, разрушаются в процессе автоклавирования и поэтому их следует добавлять в агар после стерилизации пока он жидкий. Один антибиотик, сульфат гентамицина, выдерживает автоклавирование и эффективен против широкого круга бактерий. Антибиотики негативно влияют на мицелий некоторых видов грибов.

Десятки обогащённых агаровых сред были успешно использованы для культивации грибов и у каждого грибовода складываются свои предпочтения основанные на личном опыте. Независимо от типа используемой агаровой среды, важнейшей её характеристикой является pH – логарифмическая шкала отмечающая уровень кислотности или щёлочности в диапазоне от 0 (кислота) до 14 (щелочь), где 7 нейтральный уровень. Различные виды Psilocybe предпочитают носитель сбалансированный между 6,0–7,0, тогда как Agaricus brunnescens и близкие к нему лучше растут в нейтральной среде. По большей части мицелий достаточно терпелив и хорошо растёт в промежутке 5.5–7.5 pH. О показателе pH стоит беспокоиться только тогда, когда на носителе не прорастают споры или рост мицелия чрезвычайно замедлен.

Ниже приведены несколько формул сбалансированных питательных сред обогащённого агара, в высшей степени пригодных для выращивания мицелия видов Agaricus, Pleurotus, Lentinus, Stropharia, Lepisia, Flammulina, Volvariella, Panaeolus и Psilocybe. Из приведённых формул авторы предпочитают две: PDY (картофельный с декстрозой и дрожжами – Potato Dextrose Yeast) и MPG (зерновой с солодом и пептоном – Malt Peptone Grain) агаровые составы. Добавлением в любому составу молотой ржи или зернового экстракта можно добиться преобладающего роста нитевидного мицелия, т.е. наиболее предпочитаемого за его быстрый рост.

Выберите формулу, смешайте ингредиенты в сухом виде, поместите всё в мерную чашку и добавляйте воду пока не получите литр состава.

PDY (картофельный с декстрозой и дрожжами) агар
300 гр картофеля кипятить час в литре воды, отфильтровать
10 гр декстрозы (глюкозы)
20 гр дрожжей
20 гр агара

MEA (агар на солодовом экстракте)
20 гр желто-коричневого солода
2 гр дрожжей (по усмотрению)
20 гр агара
(избегайте использования тёмного пивного карамелизованного солода, требуемый солод именно светлого, слегка подрумяненного цвета, более сыпучий и не липкий)

MPG (агар зерновой с солодом и пептоном)
20 гр желто-коричневого солода
5 гр молотых зёрен ржи
5 гр пептона или неопептона
2 гр дрожжей (по усмотрению)
20 гр агара

Для сдерживания роста бактерий на каждый литр воды до стерилизации можно добавлять 0,1 гр 60–80% сульфата гентамицина (см. Приложение VII).

Качество воды, её pH и минеральный состав отличаются в зависимости от региона. Если качество вашей воды находится под сомнением, рекомендуем использовать дистиллированную воду. Для практических нужд, тем не менее, сгодиться и вода из водопровода без особого вреда для мицелия. В некоторых случаях сбалансированный уровень pH важен, например для проращивания спор или разведения мицелия экзотических видов грибов. Изменить pH носителя можно добавляя в него по капле соляной кислоты (HCL) или каустическую соду (NaOH). Затем основательно перемешав состав, нужно снова измерить его уровень pH. (pH соляной кислоты – 0; pH каустической соды – 12; pH дистиллированной воды – 7).

Тщательно смешав все ингредиенты стерилизуйте состав в скороварке в течении 30 минут при давлении в 1,05 атм (15 psi). (Скороварка является безопасным и эффективным средством стерилизации субстратов при условии использования строго в соответствии с инструкцией производителя). Для автоклавирования агара рекомендуем использовать колбу с узким горлом. Если у вас нет специально приспособленного для этого сосуда, подойдёт любая похожая по форме бутылка. Обязательно заткните горлышко ватным тампоном и прикройте сверху фольгой до помещения в скороварку. Колбу можно наполнить только на 2/3–3/4 от полного объёма.

Наполненный сосуд поместите в скороварку налив достаточное для образования пара количество воды. (Обычно достаточно 1 см от дна). Приведите скороварку в рабочее состояние следуя инструкции производителя. Поставьте её на огонь и дождитесь появления густой струи пара. Выждав 4–5 минут закройте паровой клапан. Медленно поднимите давление до 1,05 ат (15 psi) и поддерживайте его в течении получаса. Не позволяйте температуре подниматься выше 121°C, в противном случае сахар в агаровой среде карамелизуется. Карамелизованный сахар в носителе подавляет рост мицелия и повышает вероятность генетических мутаций.

В лаборатории следует иметь стерильную тряпичную ухватку или кусок свежевыстиранной ткани для удобства обращения с горячей посудой с агаром. Пока стерилизуется носитель вымойте лабораторию до безупречной чистоты.

Время необходимое для стерилизации разнится в зависимости от высоты над уровнем моря. В неизменном объёме существует прямая зависимость между давлением и температурой (известная как закон Бойля-Мариотта). Когда рекомендуется определённое давление (равно как и температура), оно основано на стандартной высоте над уровнем моря. Культиваторам проживающим в местах расположенных значительно выше уровня моря придётся стерилизовать дольше и при более высоком давлении, чтобы достигнуть того же эффекта. Ниже приведена сокращённая таблица показывающая зависимость между давлением и температурой, и изменение температуры закипания воды на различных высотах. Увеличивайте рекомендованное давление исходя из температуры кипения воды зависящей от вашего положения над уровнем моря. К примеру на высоте в 1,5 километра температура кипения воды снизится приблизительно на 5,5°C. Это значит что давление необходимо увеличить до 1.4 ат (20 psi), т.е. на 0,35 от рекомендуемых 1,05 ат (15 psi). Смотрите в таблице требуемое давление при изменении температуры на 5°C. (На самом деле температура остаётся прежней, а вот давление изменится).

http://sci.aha.ru/ALL/b17.htm – зависимость температуры кипения воды от давления

http://lulinalex.by.ru/Texts/Tourism/Pressure.htm – соответствие атмосферного давления высоте над уровнем моря и температуре кипения воды

Заметьте что эффект стерилизации получаемый при кипячении в течении 60 минут с давлением в 1,05 ат (15 psi) будет таким же от 30 минут с 2.1 ат (60 psi). Таким образом увеличение давления вдвое сократит время стерилизации вполовину. Но большинство скороварок не могут работать с таким давлением. Ещё некоторое время всё-таки стоит прибавить для достаточно хорошего проникновения пара в субстрат, особенно если используется большой и плотно загруженный автоклав.

После стерилизации поместите скороварку в лабораторию или комнату с условиями близкими к стерильным и до того как откроете дайте давлению в ней выровняться с атмосферным. Одним литром агара можно сполна залить 30 чашек Петри размером 100 x 15 мм. Способы разлива агара отличаются от грибовода к грибоводу. Если нужно разлить только одну или две стопки по десять чашек, их можно разложить на рабочем столе все рядом. Если необходимо приготовить больше чем две стопки или поверхность рабочего стола ограничена, тогда более удобно будет разливать перемещая чашки из стопки в стопку.

Перед разливом энергично взболтайте колбу с расплавленным агаром для равномерного распределения питательных веществ. Опытные культиваторы наполняют чашки в темпе и без перерывов. Если разливаемый агар всё ещё очень горячий, на крышке чашки Петри может образоваться конденсат. Чтобы уменьшить количество конденсата, можете подождать некоторое время перед тем как разливать агар. Если после того как давление выровняется скороварка постоит ещё 45 минут, то посуду с жидким носителем можно будет брать в руки не опасаясь обжечься.

От выбранного гриба можно получить два типа культуры: произвести новый мицелий из спор или клонировать живую ткань гриба. Каждый из способов даёт в результате жизнеспособный мицелий. У обоих способов есть свои преимущества и недостатки.

Получение культуры из спор

Грибную культуру можно произвести одним из двух способов. Большинство плодоводов начинают культуру из спор. Преимущество использования спор заключается в том, что они сохраняют всхожесть от недель до месяцев после того как плодовое тело произведшее их разложилось. Другой путь получения культуры – вырезать кусочек ткани из внутренней части живого образца, в сущности клонировав его. Образец ткани для культуры необходимо взять в течении одного или двух дней после того как гриб был сорван, иначе с каждым днём будет всё труднее получить здоровый клон мицелия.

Получение спорового отпечатка

Для того чтобы собрать споры отделите шляпку от ножки свежего, хорошо очищенного гриба и положите её пластинками вниз на лист чистой белой бумаги или на чистую стеклянную поверхность, типа предметного стекла для микроскопа. Если шляпка частично высохла, добавьте каплю чистой воды для облегчения спороношения. Для уменьшения высыхания за счёт испарения и защиты от воздушных потоков накройте шляпку гриба чашкой или стеклом. Через несколько часов споры упадут в соответствии с радиальной симметрией гимениальных пластинок. Если вы использовали бумагу, вырежьте отпечаток, сложите пополам, положите в воздухонепроницаемый контейнер и надпишите дату, вид и номер сбора. Если использовалось предметное стекло, то споры можно накрыть таким же стеклом и обернуть плёнкой во избежание проникновения спор контаминантов. Неаккуратно взятый или хранимый отпечаток, будет инфицирован и шансы на получение чистой культуры из него резко упадут.

Agaricus brunnescens, Psilocybe cubensis и многие другие виды грибов обладают частичной вуалью – тонким слоем ткани растягивающимся от краёв шляпки к ножке. Вуаль может помочь в получении спор почти свободных от контаминантов. Вуаль прикрывает пластинки снаружи, создавая практически стерильные условия внутри и споры можно получить не сильно опасаясь заражения. Выбрав молодой и здоровый образец с сохранившейся вуалью и затем убрав её в асептических условиях, можно получить практически чистый споровый отпечаток. Это идеальный путь для начала мультиспоровой культуры.

Способы проращивания спор

Получив отпечаток, можно начинать производство грибной культуры. Простерилизуйте инокуляционную петлю или скальпель поместив его в пламя спиртовки или бутановой горелки на пять или десять секунд, пока он не разогреется докрасна. (Если используется бутановая горелка, приберите её пламя до минимума, чтобы минимизировать перемещение воздушных потоков). Охладите скальпель поместив его кончик в стерильную среду в чашке Петри и затем соскребите немного спор с отпечатка. Перенесите их на агар проведя по его поверхности скальпелем. Подобного результата можно добиться потерев скальпелем по отпечатку, так чтобы споры сами упали в открытую чашку Петри. Начиная культуру со спор, желательно заразить как минимум три чашки с агаром, чтобы получить хорошие шансы на всхожесть. Мицелий выращенный таким образом называется мультиспоровой культурой.

Только выпав из шляпки споры представляют собой влажные набухшие клетки с высоким процентом всхожести. С течением времени они высыхают, разрушаясь и сжимаясь ближе к центру и им уже не так просто прорасти. Вероятность прорастания обезвоженных спор увеличивается после замачивания их в стерильной воде. Простерилизуйте в течении 30 минут при 1,05 ат (15 psi) пипетку или шприц и пробирку с водой или колбу Эрленмейера на 25–250 мл с горлышком заткнутым ватным тампоном и накрытым алюминиевой фольгой. Возьмите немного спор на кончик скальпеля и опустите их в стерильную воду. Плотно закройте и дайте отстояться 6–12 часов. Выждав положенное время наберите немного воды со спорами в пипетку или шприц и проинокулируйте несколько чашек с агаром одной или двумя каплями. Помните о том, что споровый отпечаток обычно берётся в антисанитарных условиях и таким способом вы даёте возможность прорасти не только грибным, но и спорам контаминантов.

Характерные признаки грибного мицелия

Независимо от способа инокуляции или проращивания, заражение на любых начальных стадиях станет заметно уже на сроке от трёх до семи дней. Прорастающие споры выглядят как нитеподобные состоящие из клеток волоски исходящие из точки происхождения. Эти ниточки мицелия поначалу серые и разрозненные вскоре становятся белыми по мере ветвления соединяются перемычками, разрастаются и распространяются по носителю.

Мицелий большинства видов, таких как Agaricus, Coprinus, Lentinus, Panaeolus и Psilocybe на вид имеет цвет от сероватого до белого. Другие виды имеют различную пигментацию мицелия. Мицелий Lepisfa nuda может быть заметно багрянисто-синим; у Psilocybe tampanensis часто разноцветный с уклоном в коричневые тона. Помните однако, что цвет мицелия зависит даже от штамма или используемого типа субстрата. Другая сторона внешнего вида мицелия это какой тип роста он показывает: воздушный или плотный, пушистый или корнеподобный. Воздушный мицелий может быть отличительной чертой вида или результатом избытка влаги. Плотный мицелий тоже может быть признаком вида или показателем сухих условий произрастания. Более детально типы мицелия обсуждаются ниже в подразделе о сегментировании (см. цветные фото 1–4).

После того как мицелий был определён как грибной, места произрастания спор следует перенести в новые чашки Петри с агаром. Таким образом грибовод выборочно изолирует грибной мицелий, и вскоре получает чистую, свободную от заражений культуру. Если одновременно с мицелием на агаре появились признаки заражения, то участки с проросшим мицелием следует вырезать и удалить от колоний контаминантов. Т.к. большинство распространённых контаминантов это плесени размножающиеся спорами, будьте осторожны и постарайтесь не трясти ёмкость с культурой, и не делайте ничего что могло бы рассыпать споры. Также перед тем как резать агар убедитесь, что скальпель охлаждён. Раскалённый скальпель при соприкосновении с агаром произведёт реактивный выброс пара, что в пределах пространства чашки Петри вызовет перемещение воздуха и рассеет споры соседствующих плесеней.

Ответвления мультиспоровой культуры

Мультиспоровая культура это наименее сложный способ получения жизнеспособного мицелия, но не абсолютно чистого штамма. Прорастая в большом количестве, споры фактически создают множество штаммов, некоторые из которых несовместимы с другими, обладают разными потенциалами роста и нуждаются в различных условиях для плодоношения. Такая смесь штаммов подавляет рост более активных из них. В целом штаммы полученные из спор с большой вероятностью наследуют свойства своих предков. Если родители быстро захватывали субстрат и хорошо плодоносили в лабораторных условиях, то можно ожидать схожего поведения и от потомства. Культуры же полученные от дикорастущих образцов напортив в искусственных условиях обычно плодоносят плохо. Как и в случае с дикорастущими растениями, штаммы дикорастущих грибов необходимо совершенствовать селекцией.

Из многих штаммов получаемых из спор некоторые могут быть способны только на вегетативный рост. Такой мицелий может усваивать питательные вещества, но не способен образовывать плодовые тела (следствие генеративного роста). Клеточная сеть растущая из единственной споры называется монокариотической. Монокариоты не способны к производству спорообразующих плодовых тел. При встрече и слиянии двух совместимых монокариотов происходит обмен цитоплазматическим и генным материалом. Полученный в результате дикариотический мицелий уже может производить плодовитое потомство. Сетеобразное объединение ветвей различных дикариотических штаммов называется анастомоз. Такая рекомбинация возможна на любой стадии выращивания мицелия: на агаре, зерне, или уже в бедном субстрате. Подобные пересечения грибных штаммов аналогичны созданию гибридов в садоводстве.

Другой способ создания культуры заключается в выделении отдельных спор разбавлением в объёме стерильной воды. Далее эта споровая взвесь разводится ещё бóльшим количеством стерильной воды, которое уже в свою очередь и используется для инокуляции чашек с носителем. В этом случае культиватор получает возможность наблюдать за отдельными монокариотами и самостоятельно управлять процессами слияния для выведения высокоурожайных штаммов. Плодоводы нуждающиеся исключительно лишь в получении жизнеспособных культур эту технику могут опустить, т.к. их должно полностью удовлетворить мультиспоровое разведение. Но для тех, кто заинтересован в скрещивании монокариотических штаммов и изучении характеристик получаемых таким образом культур, этот метод окажется бесценным. Помните, что из сотни спор прорастает в среднем от одной до пяти. Штаммы и генетика штаммов более детально обсуждаются в Главе XV.

Наибольшая опасность в приготовлении концентрированных мультиспоровых взвесей скрывается в увеличенной вероятности заражения, особенно бактериального. Некоторые бактерии паразитируют на клеточных оболочках мицелия, тогда как другие стимулируют прорастание спор для дальнейшего перемещения и медленного переваривания самого мицелия. Поэтому некоторые штаммы нездоровы изначально и обычно ассоциируются с высоким уровнем заражений. При попытке прорастить споры в очень большом количестве, те из них что уже инфицированы увеличивают вероятность распространения болезни на соседние.

Многие грибы, тем не менее, образуют уникальные симбиотические связи с другими микроорганизмами. Как ни удивительно, некоторые бактерии и дрожжи стимулируют развитие спор, которые в случае стерильной культуры было бы сложно прорастить. Споры Cantharellus cibarius, обычной и высоко ценимой лисички, не прорастали в искусственных условиях, противостоя усилиям лучших микологов мира. Но относительно недавно шведский миколог Nils Fries (1979) установил, что при добавлении в среду активированного угля и красных дрожжей (Rhodotorula glutinis (Fres.) Harrison) споры вскоре успешно прорастают. (Использование активированного угля рекомендуется для любых грибов с затруднённой всхожестью спор.)

Многие плодоводы сообщают, что определённые культуры пышно разрастаются при случайном заражении или намеренном внесении бактерий. Было установлено что Pseudomonas putida, Bacillus megaterium, Azotobacter vinelandii и некоторые другие микробы оказывают схожий эффект на различные виды грибов — и на прорастание спор, и на рост мицелия или образование плодовых тел. (Curto и Favelli, 1972; использование этих бактерий рассматривается в Приложении III). Однако большинство контаминантов с которыми приходится сталкиваться при разведении грибов, перенесены ли они воздушным путём или уже находились на спорах, делу не помогают. Из всех конкурентов наиболее пагубны бактерии. Прилежное соблюдение норм лабораторной гигиены, использование HEPA-фильтров и правильные методы лабораторной работы призваны справится с этой напастью.

Получение культуры из живой ткани

Культура из ткани является гарантированным способом сохранения соответствующих генетических признаков конкретного гриба. Мицелий полученный из ткани в точности клонирует образец, тогда как мультиспоровая культура образует новый штамм. Ткань для клонирования гриба необходимо брать в течении 24–48 часов с момента сбора. Выделение чистой культуры вызовет затруднения, если образец уже пролежал несколько дней, слишком сухой или перезрелый. С другой стороны споры сохраняются в течение долгого времени.

Так как весь гриб состоит из уплотнённого мицелия, то жизнеспособную культуру можно получить из любой части плодового тела гриба. Шляпка, верхняя часть ножки и/или область где пластинки соединяются с нижней частью шляпки являются лучшими местами для иссечения чистой ткани. Шляпку некоторых грибов покрывает кутикула. Сорвав эту тонкую кожицу также можно взять ткань из мякоти расположенной под ней. Протрите поверхность гриба ватным тампоном смоченным в спирте и удалите всю грязь и повреждённую внешнюю ткань. Надломите шляпку или ножку гриба, обнажая его внутренние гифы. Незамедлительно разогрейте скальпель докрасна и остудите его в чашке Петри со средой. Теперь надрежьте мякоть и извлеките маленький кусочек ткани гриба. Перенесите этот фрагмент ткани в центр чашки Петри с питательной средой как можно быстрее, избегая продолжительного контакта как ткани так и агара с открытым воздухом. Повторите все действия и поместите культуру ещё в три или ещё лучше пять чашек. Пометьте каждую чашку видом гриба, датой, типом культуры (ткань) и разновидностью агаровой среды. При благоприятном стечении обстоятельств по прошествии от трёх до семи дней рост мицелия будет очевиден.

10% – это общесредний уровень заражений, с которым грибовод может смириться. Тем не менее в первичных культурах, когда образцы берутся от диких видов, не будет чем-то  необычным уровень контаминации в 25%. Разнообразные и красочные заражения появляются обычно недалеко от точки пересадки на агар. Количество появившихся контаминантов зависит от чистоты образца ткани или спор, а также от гигиенический условий лаборатории. В культуре клонированной из ткани гриба чаще всего встречаются бактериальные заражения.

Заражение это факт жизни каждого грибовода. Контаминанты только тогда становятся проблемой, когда их количество увеличивается сверх всяких разумных пределов, что можно считать признаком грядущей катастрофы в лаборатории. Если пять, десять или даже пятнадцать процентов можно считать нормальным уровнем контаминации для любого культиватора, то резкий скачок без каких-либо видимых изменений в условиях поддержания гигиены может стать причиной для поисков новых способов борьбы.

Как только ткань покажет признаки роста её следует переместить в другую чашку. Если нет явных признаков заражения, то быстрая пересадка не столь необходима. Если по соседству уже развивается плесень и готовится выбросить споры, то культуру следует сразу же изолировать. Продолжайте переносить культуру, отделяя её от контаминантов, пока не получите чистый штамм. Очевидно что выделить мицелий из частично заражённой культуры гораздо сложнее, чем пересадить из чистой. Попытки изолировать мицелий от соседствующих контаминантов усложняются опасностью распространения их спор. К тому же незримо для нас, когда мы поднимаем крышку чашки Петри в неё врывается внешний воздух и споры плесени разносятся его потоками в атмосферу лаборатории. Таким образом, чем быстрее культиватор обретёт независимость от инфицированных чашек, тем скорее сможет вывести чистую культуру. Тем не менее помните, что не смотря на то что невооружённому глазу культура может казаться чистой, в ней всё ещё могут скрываться споры контаминантов. Присутствие затаившихся плесеней или бактерий в мицелии станет видимым только тогда, когда вы инокулируете им стерильное зерно.

Различные меры могут быть предприняты для минимизации уровня заражения в лаборатории. Мы уже обсудили применение распыляемого масла, HEPA-фильтров и главбоксов. Но ваше личное отношение к заражению и чистоте в лаборатории много важнее любой её части. Авторам случалось видеть высокотехнологичные лаборатории с высоким уровнем контаминации и чуланы с относительно низким. Дадим два совета, придерживаясь которых, начинающие культиваторы должны преуспеть:

1. Приложите максимум стараний к первой попытке создания стерильной культуры. Всё должно быть чисто: лаборатория, одежда, инструменты и особенно сам культиватор.

2. Получив чистую культуру примените максимум усилий для поддержания её чистоты. Сохраняйте только те чашки Петри, в которых нет признаков плесени или бактерий. Выбрасывайте все инфицированные чашки, несмотря на то что они могут быть заражены только частично.

Не отчаивайтесь если столкнётесь с неудачей после первой попытки. Работа со стерильными культурами пойдёт просто и гладко, но только после некоторой практики, когда вы наберётесь немного опыта.

Работа с агаром это только первый шаг в разведении грибов. Для выращивания грибов сам по себе агар непрактичен. Его преимущества для работы с грибной культурой заключаются в возможности быстро разрастить мицелий из малейшего кусочка ткани. И достаточно легко поддерживать чистоту такой культуры, т.к. любое заражение легко заметить на плоской поверхности агаровой среды в чашке Петри.

Сегментирование: селекция и улучшение штаммов

Захватывая поверхность агара мицелий демонстрирует поразительное разнообразие форм. Некоторые культуры довольно однообразны на вид, тогда как другие поначалу проявляя полиморфность (неоднородность) позже неожиданно развиваются в гомогенный (однородный) мицелий. В этом природа мицелия – непрерывно изменяться и эволюционировать.

Мицелий называется сегментированным когда, развиваясь из единственной точки инокуляции в разные стороны, он показывает разные типы роста. Сегмент определяется исключительно по внешнему виду контрастирующему с окружающим преобладающим типом мицелием. Существует два основных типа роста мицелия: ризоморфный (корнеобразный, нитевидный) и войлочно-опушённый (ватный, облачками). К тому же встречаются и промежуточные типы линейного роста, ориентированные относительно радиальных направляющих (к стенкам чашки), но не имеющие выраженных скрученных нитей или переплетённых гифов характерных для ризоморфного типа роста. Ризоморфный мицелий более предрасположен к образованию примордий. Линейный мицелий тоже склонен к обильному образованию примордий, но делает это обычно после того как преобразуется в ризоморфный. Однако не забывайте о том, что характеристики внешнего вида плодоносящего мицелия так же зависят о разновидности гриба и могут немного отличаться от приведённых выше.

В чашке плотно поросшей ватным мицелием, веероподобная веточка жилистого мицелия будет называться ризоморфным сектором, и наоборот. Сегментирование очень часто встречается на культуре грибов, но так же очень мало известно о назначении и причинах появления сегментов. Очевидно, что большую роль в этом играют генетические свойства, возраст мицелия и состав питательной среды.

Согласно Stoller (1962) рост пушистых сегментов обусловлен присутствием в субстрате взорванных или сломанных зёрен, которые увеличивают содержание крахмала в носителе грибницы. Работая с Agaricus brunnescens Stoller заметил, что рост мицелия быстрее при высоких значениях pH (7,5), чем при отклонении pH в кислотность (6,5), но сегментирование случается чаще. Он выяснил что сегментирование на зерне можно сократить, уменьшив количество раскрывшихся зёрен (результат наличия избыточной влаги), и понизив pH до 6,5 используя комбинацию мела (углекислый карбонат кальция) и гипса (сульфат кальция).

Коммерческие грибоводы давно заметили, что медленно растущий ватный мицелий уступает более быстрому ризоморфному. Существует несомненная зависимость между пушистым видом мицелия на агаре и последующим образованием «стромы», плотного сплетения гифов мицелия покрывающего кейсинг, через которое редко прорастают грибы. Кроме того, примордии чаще образуются на ориентированном на плодообразование ризоморфном, нежели на склонном к вегетативному росту, ватном мицелии. И ещё один интересный факт: при наблюдении под микроскопом гифы ризоморфного мицелия выглядят более толстыми и менее разветвлёнными, чем у ватного.

Ризоморфный мицелий быстрее захватывает субстрат, образует больше примордий и в результате лучше плодоносит, чем пушистый мицелий. Это видно на Фото 37. Ломтик был пересажен на агар и из него выросли два различных типа мицелия. Сегмент с нитевидным ростом образовал многочисленные примордии, тогда как на ватном мицелии ничего не появилось – такое часто случается на агаре.

По мере роста мицелий постепенно начинает стареть. Стареющий мицелий, как и любое пожилое растение или животное, гораздо менее жизнеспособен и плодовит, чем молодой. Вообще превращение мицелия из нитевидного в ватный служит сигналом начала вырождения штамма. Если культура, изначально ризоморфная, со временем начинает сегментироваться, существует несколько способов предотвращения деградации штамма и сохранения ризоморфизма.

1. Производить пересадку только ризоморфных секторов и избегать ватных.
2. Регулярно меняйте питательный носитель используя приведённые здесь формулы. Не желательно использовать одну и ту же агаровую среду, т.к. питательный состав носителя выборочно воздействует на возможность выработки различных пищеварительный ферментов грибным мицелием. Изменение компонентов среды позволяет сохранить широкую ориентированность пищеварительной системы и повысить выживаемость мицелия. Виды сильно отличаются по своим предпочтениям. И если у вас нет определённых данных на этот счёт, то вам придётся идти путём проб и ошибок.
3. Получив количество мицелия необходимое для производства грибницы верните штамм на хранение до следующего использования. Не ждите что мицелий росший несколько лет при оптимальных температурах сохранит свойства первоначальной культуры из которой он был получен. Вследствие многочисленных делений клеток и непрерывных пересадок с большой вероятностью выделился подштамм, который имеет отдалённое сходство с жизнеспособностью, внешним видом и потенциалом плодоношения оригинала.
4. Если все усилия направленные на сохранение жизнеспособного штамма провалились, следует выделить новый из мультиспоровой культуры.
5. Другой альтернативой являются постоянные эксперименты с целью создания гибрида штаммов скрещивая дикариотические мицелии двух генетически отличающихся родителей. (Однако эксперименты с Agaricus brunnescens показали что большая часть гибридов плодоносит меньше, чем кто-либо  из задействованных в скрещивании штаммов. И лишь меньшая их часть даёт хорошие урожаи.)

Домашние культиваторы могут выборочно развивать штаммы грибов выбирая мицелий по следующим нескольким признакам:

1. Ризоморфизм – быстро развивающийся и разрастающийся мицелий
2. Чистота штамма – отсутствие ватных секторов.
3. Чистота мицелия – отсутствие конкурирующих микроорганизмов (бактерий, плесеней и клещей).
4. Время задержки реакции в ответ на создание условий благоприятствующих образованию примордий.
5. Количество появившихся примордий.
6. Коэффициент прорастания появившихся примордий.
7. Размер, форма и/или цвет плодовых тел.
8. Общий урожай.
9. Сопротивляемость заболеваниям.
10. Чувствительность/переносимость C02.
11. Температурные ограничения.
12. Простота сбора урожая.

Используя эти характерные особенности, грибные селекционеры смогут разумно оценить качество штаммы и со временем научатся выбирать из них те, которые наилучшим образом соответствуют их предпочтениям.

Хранение культур: способы консервации грибных штаммов

Получив чистый изолированный штамм, благоразумным решением будет сохранить его путём консервации. Консервированные культуры или, как их обычно называют, «скосы» – это стеклянные пробирки наполненные стерильным носителем и проинокулированные мицелием. Подходящий размер пробирки для хранения культур 20х100 мм, с плотно подогнанной пробкой. У каждого опытного культиватора имеется своя коллекция культур называемая «банк видов». Банк видов является неотъемлемой частью процесса разведения грибов. С его помощью грибовод может сохранять штаммы годами.

Для приготовления скосов сначала смешайте компоненты агаровой среды используя обсуждавшиеся выше в этой главе формулы. Наполните пробирки на треть от их высоты, заткните ватным тампоном и накройте алюминиевой фольгой, или просто закройте пробкой подходящего размера. Стерилизуйте в скороварке 30 минут при давлении в 1,05 атм (15 psi). Дождитесь пока давление в скороварке сравняется с атмосферным и переместите её в стерильную комнату не открывая. Достаньте пробирки, мягко взболтайте их для равномерного распределения питательных веществ и расположите их под углом 15–30 градусов до охлаждения и затвердевания.

По мере готовности проинокулируйте скосы фрагментами мицелия. Пометьте каждую пробирку датой, типом агара, видом и штаммом. Для подстраховки сделайте как минимум три скоса на каждый штамм. Инкубируйте в течении недели при температуре 24°C. Как только мицелий покроет основную поверхность агара и на поверку окажется свободным от заражений, помещайте на хранение при температуре 2–4°C. При таких температурах снижается метаболическая активность большей части мицелия и практически прекращается поглощение питательных веществ. В идеале неплохо бы проверять жизнеспособность хранимого мицелия каждые полгода, высаживая его фрагменты в новые чашки Петри. После того как мицелий захватит ⅔ поверхности носителя в чашке, отберите сильный (ризоморфный) мицелий и проинокулируйте новые скосы. Подпишите и храните их пока они вам не понадобятся. Зачастую, проращивание такой миникультуры становится хорошей проверкой хранимого штамма на всхожесть и плодовитость.

Превосходным способом сохранения культур является передача дубликатов видов и штаммов знакомым коллегам культиваторам. Штаммы грибов теряются иногда с бóльшей лёгкостью, чем от них того ожидают. А потеряв, вы никогда уже не сможете их вернуть.

Вышеописанный метод помогает надёжно сохранять культуры в большинстве случаев. Тем не менее некоторые алчные культиваторы с лёгкостью могут обзавестись пятидесятью, а то и сотней штаммов и необходимость постоянного поддержания их жизнеспособности может стать утомительной и обременительной. Когда библиотека культур разрастается до таких объёмов существует несколько дополнительных мер позволяющих увеличить срок хранения штаммов.

Простейший способ консервации культур на долгий срок использует тонкий слой стерильного минерального масла наносимого на живой мицелий после его прорастания в пробирке. Минеральное масло не токсично для мицелия, сильно снижает его метаболизм и препятствует испарению влаги из агаровой основы. После этого культура хранится при 3–5°C до востребования. Недавние исследования (Perrin, 1979) показали, что все 30 видов грибов хранимых под минеральным маслом на протяжении 27 лет произвели живой мицелий. Для возобновления штаммов скосы были перевёрнуты вверх ногами для того чтобы стекло масло, и затем инкубированы при 25°C. В течение трёх недель каждый скос показал обновлённые признаки роста и будучи перенесёнными на агар дали незаражённые культуры.

Четыре других способа консервации включают: погружение скосов в жидкий азот (дорогостоящая процедура); инокуляция стерильного компоста на основе конского навоза и соломы с последующим хранением при 2–3°C (см. Главу V о приготовлении компоста); инокуляция носителя на основе опилок и отрубей мицелием грибов предпочитающих дерево (см. Главу III об альтернативных носителях мицелия); или хранение спор в тёмном прохладном месте – возможно наипростейший способ для домашних культиваторов.


Независимо от используемого способа консервации помните, что для грибов естественно плодоносить, спорулировать и развиваться. Методы культивации должны развиваться вместе с грибами и культиватор должен выборочно изолировать и поддерживать многообещающие штаммы по мере их появления. Так что не удивляйтесь если спустя пять лет хранения штамм слабо похож на оригинальный по характеристикам плодоношения и форме.


24.05.2011, 4842 просмотра.

Главная Чтение и Видео Статьи Грибоводство Стерильная технология и работа с агаром
www.megastock.ru Платежная система IntellectMoney VISA
TopGrow © 2009—2013 / Создание сайта — PRODEX / HostCMS
Травка зеленеет →